Voor zijn derde tocht (1628-1629) behield hij de titels van kapitein-generaal en admiraal. Zijn tweede man was echter de oudere luitenant-admiraal Hendrick Lonck, die dus anciënniteit had. In de 17e eeuw lag, ook in de burgerlijke Republiek, het rangonderscheid altijd uiterst gevoelig. Iedereen lette steeds goed op of hij overeenkomstig zijn positie - en dus niet "min-achtend" - werd behandeld om statusval te voorkomen. Om die gevoeligheden te ontzien, noemde Hein zich op deze expeditie systematisch "generaal" en Lonck was dan de "admiraal".

De WIC zond in 1628 drie vloten naar Amerika. Dirck Symenssoon Uitgeest viel Brazilië aan met twaalf schepen; Pieter Adriaenszoon Ita ging met een even groot aantal vast voorop naar de Caraïben. Hein vertrok met 31 schepen en 4000 man op 13 april met het uitdrukkelijke doel de Spaanse schatvloot te onderscheppen, die onder meer met zilver, indigo en cochenille beladen onderweg was naar Spanje. Zijn vlaggenschip was de Amsterdam met vijftig kanonnen; zijn vlaggenkapitein de latere viceadmiraal Witte de With. Viceadmiraal en derde man was Joost van Trappen Banckert van de Zeeuwse Kamer van de WIC, de vader van de latere luitenant-admiraal Adriaen Banckert. Hoewel met Hein, De With en Banckert (de "gesel der Spanjaarden") drie van de grootste vechtjassen uit de Nederlandse maritieme geschiedenis op één vloot verenigd waren, had de expeditie meer door geluk dan dapperheid succes.

Omdat de plannen al in een vroeg stadium door de corruptie van de klerken waren uitgelekt, keek heel Europa gespannen toe of het Hein zou lukken. De Terra Firma-vloot uit Zuid-Amerika die het zilver uit Peru moest vervoeren, bleef in de havens liggen toen het duidelijk werd dat Hein inderdaad in het gebied aanwezig was. De St-Jacobsvloot uit Mexico werd echter niet op tijd gewaarschuwd en voer uit naar Cuba, waar een storm een gedeelte naar de Nederlandse vloot dreef die in de buurt van Havana al een tijd te wachten lag en bijna op het punt stond terug te keren. Op 8 september (juliaanse kalender) vielen vijftien schepen vrijwel zonder gevecht in Heins handen; tijdens de hele expeditie verloor hij slechts 150 man door ziekte en desertie.

Deze overval, de Slag in de Baai van Matanzas, leverde 11.509.524 gulden op (na aftrek van de kosten kennelijk zo'n zeven miljoen want de stadhouder had recht op 10% van de winst en kreeg volgens een latere opgaaf van Johan de Witt 700.000 guldens), een gigantisch bedrag voor die tijd: het equivalent in koopkracht van ruwweg een half miljard euro in huidig geld, terwijl de Nederlandse economie toen ongeveer twee orden van grootte kleiner was dan de huidige. Piet Hein werd daarvoor beloond met zesduizend guldens en de bemanningsleden met elk 200 gulden, wat zelfs tot oproer leidde. De verovering leverde hem de grote faam op in Nederland die tot de dag van vandaag voortduurt. Met de opbrengst van dergelijke goud- en zilvertransporten bekostigde Spanje de strijd tegen de Nederlandse opstandelingen (Tachtigjarige Oorlog).

Het verlies betekende voor de Habsburgers dus niet alleen een overeenkomend verlies aan prestige maar ook de feitelijke onmogelijkheid de oorlog nog tot een goed einde te brengen. Vanaf dat moment zou de positie van Spanje als wereldmacht binnen één generatie verloren gaan. De Republiek had nu echter het geld om in 1629 de zeer dure belegering van 's-Hertogenbosch te beginnen, de onneembaar geachte "Moerasdraeck", waardoor de Habsburgse landblokkade gebroken zou worden; een versterking van stadhouder Frederik Hendriks reputatie als "Stedendwinger", die al begonnen was met de herovering van Grolle in 1627. Toch waren er ook indirecte nadelen voor de Zeven Verenigde Nederlanden: als centrum van het ontluikende hoogkapitalisme waren ze kritisch afhankelijk van een onbelemmerde werking van de geldpomp die de zilvertransporten voor de wereldhandel waren. Het even vasthouden van het zilver veroorzaakte een dip in de wereldeconomie. Dat besefte toen echter niemand en het hele volk maakte zich op voor een heldenontvangst.